Auf jedem Analysezertifikat eines Forschungspeptids steht ein Reinheitsprozentsatz, und fast immer ist diese Zahl mittels HPLC bestimmt. Diese Anleitung erklärt, was das Verfahren tut, wie dieser Prozentsatz zustande kommt und — am wichtigsten — was er nicht aussagt.
HPLC trennt die Bestandteile einer Probe und drückt das beabsichtigte Peptid als Prozentsatz der Gesamtpeakfläche aus. Es ist also ein Verhältniswert, keine Wägung: Restwasser und Gegenionen bleiben unsichtbar, und die Identität des Moleküls bestätigt HPLC nicht.
Was ist HPLC?
HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) ist ein Trennverfahren, das die Bestandteile einer Probe auseinanderzieht und einzeln messbar macht. Die Probe wird gelöst und unter hohem Druck durch eine Säule gedrückt, die mit feinen Partikeln gefüllt ist. Jeder Bestandteil hat eine eigene Affinität zu diesem Säulenmaterial und braucht deshalb kürzer oder länger, bis er am anderen Ende erscheint.
Am Ende der Säule sitzt ein Detektor. Er registriert, was vorbeikommt und wann, und das Ergebnis ist ein Chromatogramm: eine Linie mit Peaks, wobei jeder Peak für einen Bestandteil steht, der in diesem Moment eluierte.
Wie trennt HPLC eine Peptidprobe?
Für Peptide wird praktisch immer Reversed-Phase-HPLC eingesetzt: eine unpolare Säule in Kombination mit einer wässrigen Laufmittelphase, der allmählich ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird. Je hydrophober ein Bestandteil, desto länger bleibt er an der Säule und desto später eluiert er. Diese Ankunftszeit heißt Retentionszeit.
Weil sich die Zusammensetzung des Laufmittels während der Messung verschiebt — ein Gradient — kommen auch Bestandteile, die sich in ihrer Hydrophobizität sehr ähnlich sind, als getrennte Peaks heraus. Genau das braucht man bei einem Peptid: verwandte Nebenprodukte aus der Synthese ähneln dem Zielmolekül stark.
Woher kommt dieser Reinheitsprozentsatz?
Der Reinheitsprozentsatz ist ein Flächenprozent: die Fläche des Peaks des beabsichtigten Peptids geteilt durch die Gesamtfläche aller Peaks. Bei Peptiden misst der Detektor üblicherweise die UV-Absorption um 214 nm, die Wellenlänge, bei der die Peptidbindung selbst absorbiert — praktisch, denn dann wird jeder peptidartige Bestandteil gesehen, nicht nur die mit einer aromatischen Aminosäure.
Stehen also 99,2 % auf einem Zertifikat, bedeutet das: 99,2 % der Peakfläche gehörten zum Zielmolekül und 0,8 % zu etwas anderem. Wie so ein Bericht zu lesen ist, steht in wie liest man ein COA.
Reinheit ist nicht dasselbe wie Peptidgehalt
Hier liegt die meiste Verwirrung: 99 % Reinheit bedeutet nicht, dass 99 % des Vial-Inhalts Peptid ist. Ein lyophilisiertes Peptid enthält neben dem Molekül selbst auch Restwasser und Gegenionen — bei der Peptidsynthese häufig Trifluoressigsäure (TFA) oder Acetat. Die tragen zum Gewicht im Vial bei, aber nicht zur Peakfläche im Chromatogramm.
Der Netto-Peptidgehalt ist daher eine eigene Bestimmung, die ein Zertifikat enthalten kann oder nicht. Für Forschung, in der die exakte Stoffmenge zählt, ist das die Zahl, auf die es ankommt — nicht der Reinheitsprozentsatz. Unsere eigenen Schwellen stehen auf Qualitätsstandards.
Was HPLC nicht aussagt
HPLC quantifiziert, identifiziert aber nicht: eine Retentionszeit passt zu einem Stoff, ohne zu beweisen, welcher Stoff es ist. Dafür braucht es Massenspektrometrie, die das Molekulargewicht misst und so die molekulare Identität bestätigt. Diese beiden Messungen zusammen sind das Minimum, um eine Charge als charakterisiert zu betrachten.
Und darüber hinaus: eine Reinheitsmessung sagt nichts über Sterilität, Endotoxine oder die Eignung für irgendeine Anwendung. Wer unsere Chargen misst und warum das ein Dritter ist, steht auf Janoshik Analytical.
Diese Informationen sind allgemein und dienen der Aufklärung. Peptide Lab liefert Forschungspeptide ausschließlich für Labor- und Forschungszwecke. Nicht für den menschlichen oder tierischen Verzehr, kein Arzneimittel und keine medizinische Beratung.
Häufig gestellte Fragen zu HPLC
Wofür steht HPLC?
HPLC steht für High-Performance Liquid Chromatography (Hochleistungsflüssigchromatographie). Es ist ein Trennverfahren, bei dem eine Probe unter hohem Druck durch eine Säule gedrückt wird, sodass ihre Bestandteile am Ende zu unterschiedlichen Zeitpunkten ankommen und einzeln messbar sind.
Wie wird die Reinheit mittels HPLC bestimmt?
Über die Fläche der Peaks im Chromatogramm. Die Fläche des Peaks des beabsichtigten Peptids wird als Prozentsatz der Gesamtfläche aller Peaks ausgedrückt. 99,1 % auf einem Zertifikat ist also ein Flächenprozent, keine Wägung.
Ist 99 % Reinheit dasselbe wie 99 % Peptid im Vial?
Nein. HPLC-Reinheit ist das Verhältnis zwischen dem beabsichtigten Peptid und anderen peptidbezogenen Bestandteilen, die der Detektor sieht. Restwasser und Gegenionen aus der Synthese werden darin nicht mitgerechnet. Der Netto-Peptidgehalt ist eine eigene Bestimmung.
Kann HPLC bestätigen, welches Peptid es ist?
Nicht allein. Eine Retentionszeit passt zu einem Stoff, beweist seine Identität aber nicht. Dafür braucht es Massenspektrometrie, die das Molekulargewicht misst. HPLC sagt wie viel, Massenspektrometrie sagt was.
